光合探針熒光測量技術(shù)MPF--準確獲取Fm'的新方法

光合探針熒光測量技術(shù)MPF--準確獲取Fm'的新方法


 

        準確測量光下最大熒光產(chǎn)額Fm' 是植物葉片熒光參數(shù)測量的重點和難點。Fm' 的測量不準確將導(dǎo)致一系列相關(guān)熒光參數(shù)的錯誤計算，如非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ和葉肉導(dǎo)度g_m等。

        許多研究表明Fm'會隨“飽和閃光”強度的增加而增大。PSII具有快速周轉(zhuǎn)能力，傳統(tǒng)“飽和閃光”技術(shù)無法將PSII反應(yīng)中心受體側(cè)完全還原，因此容易造成對于光下最大熒光產(chǎn)額Fm'的低估。解決方案是首先測量多個不同“飽和閃光”梯度下的表觀^AFm'， 進而建立“飽和閃光”強度的倒數(shù)與它的線性方程關(guān)系，求算當“飽和閃光”趨向于無窮大時對應(yīng)的熒光產(chǎn)額Fm'（文獻參考：Earl,H. And Ennahli, S. Estimating photosynthetic electron transport via chlorophyll fluorometry without Photosystem II light saturation. Photosynthesis Research, 2004,82 : 177~186.）。這種方法非常耗時，因此限制了其在實際測量中的應(yīng)用。

        不僅如此，在運用傳統(tǒng)“飽和閃光”技術(shù)測量時還需要假設(shè)過程速率常數(shù)（如kF, kD等）維持不變且沒有觸發(fā)副反應(yīng)，而很多研究表明上述假設(shè)在高強度“飽和閃光”下不成立。

    
        針對傳統(tǒng)“飽和閃光”存在的這些不足，美國LI-COR公司的技術(shù)團隊于2009年推出一項新技術(shù)Multiphase Flash^TM

         Multiphase Flash^TM多相閃光技術(shù)可以在一次短暫閃光過程中（～1s）快速測量多個閃光強度以及與之相對應(yīng)的熒光產(chǎn)額^AFm'，通過線性擬合準確推算^EFm'。實驗結(jié)果表明：
      （1）在不同“飽和閃光”強度下，通過Multiphase Flash^TM方法推算得到的^EFm'差異不顯著且總是高于傳統(tǒng)方法測量所得結(jié)果。通過 ^EFm' 計算得到的 ΦPSII 能比傳統(tǒng)“飽和閃光”技術(shù)測量結(jié)果高15-30%；
      （2）將 ^EFm' 計算得到的電子傳遞速率 J 與凈光合速率 A_G 建立線性方程，其斜率為4.7±0.2，即大約4.7個電子固定1個CO₂，與理論值相符，文獻請參考LI-COR專家組于2013年發(fā)表于Plant Cell & Environment的文章：“Loriaux S.D., Avenson T.J., Welles J.M., etc. Closing in on maximum yield of chlorophyll fluorescence using a single multiphase flash of sub-saturating intensity. Plant, Cell & Environment, 2013, 36(10) ：1755 ~1770.”。

        而且針對傳統(tǒng)“飽和閃光”技術(shù)測量無法避免觸發(fā)副反應(yīng)的事實，Multiphase Flash^TM技術(shù)可以在低強度“飽和閃光”下推算^EFm'，如圖所示光強4500到9000μmolm^-2s^-1，采用Multiphase Flash^TM多相閃光技術(shù)得到的^EFm'基本保持不變；而使用傳統(tǒng)“飽和閃光”技術(shù)得到的^AFm'在“飽和光強”;從4500到9000μmolm^-2s^-1變化過程中持續(xù)增加，并不見真正“飽和”?？梢?，Multiphase Flash^TM多相閃光技術(shù)能在低強度“飽和閃光”下，如4500μmolm^-2s^-1，推算出更真實的^EFm'，最大程度上減少了這些由于太過高強度飽和閃光導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生，因此非常適用于那些可能會造成光損傷植物的熒光測定。
 
 
傳統(tǒng)“飽和閃光”與Multiphase Flash^TM多相閃光技術(shù)的設(shè)計區(qū)別，

如下圖：
 
傳統(tǒng)“飽和閃光”，也叫矩形閃光（RF）測量方法：打一個飽和閃光（Q），持續(xù)大約400?1200 毫秒，期間持續(xù)記錄熒光值，選取最高熒光值為^AFm'。
 
        Multiphase Flash^TM多相閃光技術(shù)分三階段：

（1）先打一個飽和閃光（Q），持續(xù)時間大約為300毫秒，用以還原QA-PQ庫;

（2）勻速降低Q值大約300毫秒;

（3）回到最初的高Q值，保持約300毫秒，檢查閃光引起的非光化學(xué)淬滅（QN）
 
        根據(jù)第二階段獲得的Fm'值與1E4/ Q做回歸分析來估算光強無限大時的最大熒光值。
 
Multiphase Flash^TM多相閃光技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)“飽和閃光”的其他證據(jù)：
        使用Multiphase Flash^TM多相閃光技術(shù)，即曲線擬合獲取截距方法（intercept method）估算出最大的、真實的^EFm'，由^EFm'計算得到的電子傳遞速率J和總CO₂同化速率之間的效率關(guān)系是真實的，滿足理論要求的，而使用傳統(tǒng)飽和閃光單一飽和閃光（single pulse method）得到的表觀最大熒光產(chǎn)額^AFm',由^AFm'計算得到的電子傳遞速率和總CO₂同化速率之間的關(guān)系是背離理論的，明顯小于4，如下圖所示，左圖為Loriaux S.D.于2013年發(fā)表于Plant Cell & Environment上的文章所述；右圖為Earl H.于2004年發(fā)表于Photosynthesisi Research上的實驗結(jié)論。
 
電子傳遞速率J和CO₂總同化速率之間的量化關(guān)系
（理論最大效率：4個電子固定1個CO₂）
 
使用Multiphase Flash^TM多相閃光技術(shù)得到的^EFm'計算出葉肉導(dǎo)度g_m比傳統(tǒng)“飽和閃光”方法得到的^AFm'計算出的葉肉導(dǎo)度g_m更真實合理，見下圖：