文章標(biāo)題
Guard cell activity of PIF4 and HY5 control transpiration
保衛(wèi)細(xì)胞中PIF4及 HY5的活性調(diào)控蒸騰
https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2022.111583
作者 |Gilor Kelly等
翻譯 | 王露
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摘要
植物的蒸騰作用涉及到植物水力學(xué)以及植物氣孔運(yùn)動(dòng)相關(guān)背景。蒸騰過程會(huì)受到內(nèi)源以及外界環(huán)境信號(hào)的調(diào)節(jié)，而在眾多環(huán)境因子中，光起著主導(dǎo)作用。
光強(qiáng)，光質(zhì)都會(huì)影響氣孔孔徑的大小。如何調(diào)控孔徑讓植物攝入CO2的量佳，且如何讓植物水分耗散量最小，這些問題值得思索。盡管光環(huán)境變量與蒸騰之間的關(guān)系已有深入研究，但在遺傳層面，保衛(wèi)細(xì)胞如何感知這些信號(hào)，以及感受信號(hào)之后又如何影響氣孔導(dǎo)度，目前這部分研究有所局限。
而在該研究中要點(diǎn)關(guān)注兩個(gè)關(guān)鍵的光響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子HY5和PIF4，它們分別屬于bZIP家族以及BHLH家族。該研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞中過表達(dá)PIF4，會(huì)導(dǎo)致蒸騰作用降低，在pif4突變體中的表達(dá)甚至?xí)种普趄v作用。HY5在野生型擬南芥，煙草，以及hy5擬南芥突變體的保衛(wèi)細(xì)胞中過表達(dá)，會(huì)提高蒸騰速率。此外，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)HY5可逆轉(zhuǎn)己糖激酶HXK1過表達(dá)導(dǎo)致的蒸騰速率降低的情形。
1.研究背景
植物水分管理主要通過蒸騰作用進(jìn)行調(diào)節(jié)，植物蒸騰會(huì)受到內(nèi)源信號(hào)與環(huán)境信號(hào)共同調(diào)節(jié)，其中光起著主要的作用。當(dāng)光出現(xiàn)時(shí)，光信號(hào)會(huì)刺激葉片氣孔打開并且會(huì)啟動(dòng)葉片與大氣之間的日常氣體交換。光在一天中持續(xù)影響植物氣孔導(dǎo)度，進(jìn)而影響每天的氣體交換速率（H2O以及CO2的擴(kuò)散）。
光質(zhì)也會(huì)影響氣孔的開閉。氣孔打開大多是由單色藍(lán)光啟動(dòng)，較小程度上由紅光和遠(yuǎn)紅光啟動(dòng)，在紅光背景中添加藍(lán)光可增強(qiáng)晝夜氣孔導(dǎo)度，但與單獨(dú)使用紅光相比，會(huì)阻礙整體水分利用效率。為響應(yīng)光環(huán)境變化，植物的藍(lán)光與紅光受體接收到相應(yīng)信號(hào)會(huì)控制氣孔運(yùn)動(dòng)以及氣孔導(dǎo)度，該過程的下游元件調(diào)控的遺傳學(xué)背景，主要來源于幼苗光形態(tài)建成階段的研究。一些參與光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子被證明是光形態(tài)發(fā)生中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，比如光敏色素相互作用因子PIF。
PIF類因子在光信號(hào)感知以及信號(hào)轉(zhuǎn)換中起到重要的作用。而PHYB（PHYTOCHROME）是PIF的上游調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)氣孔密度以及氣孔導(dǎo)度，減少水分流失，進(jìn)而提高植物的耐旱性。突變體Phyb相比野生型植株而言氣孔更加閉合，而突變體pif3，突變體pif4，相比野生型氣孔更加打開。PIF類的轉(zhuǎn)錄因子可能處于PHYB的下游，根據(jù)光環(huán)境變化調(diào)控氣孔導(dǎo)度。而目前相關(guān)研究表明在高溫環(huán)境下，PIF4作為負(fù)調(diào)控因子調(diào)控氣孔發(fā)育。下胚軸伸長(zhǎng)因子HY5，與PIF類起拮抗作用。
光會(huì)阻止HY5的降解，HY5的靶定目標(biāo)是PIF4，HY5會(huì)使得PIF4進(jìn)行降解，所以在缺光的條件下，會(huì)通過PIF類因子促進(jìn)下胚軸伸長(zhǎng)。廣泛的遺傳育種以及生化研究已證實(shí)HY5控制光調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄變化，超過1/3的基因組會(huì)受到轉(zhuǎn)錄因子HY5的調(diào)控作用，但目前缺少HY5參與全植物蒸騰管理以響應(yīng)光變化的作用研究。盡管缺乏與HY5相關(guān)的蒸騰數(shù)據(jù)，有研究表明HY5會(huì)影響氣孔發(fā)育，發(fā)現(xiàn)HY5會(huì)靶定到STOMAGEN基因上，從而誘導(dǎo)表皮層中氣孔發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致氣孔密度以及氣孔指數(shù)（氣孔與表皮細(xì)胞的比率）的增加。
然而，有研究表明HY5影響氣孔發(fā)育是有限制條件的，認(rèn)為其跟植物接收到的日照時(shí)長(zhǎng)相關(guān)，只有在長(zhǎng)日照的環(huán)境條件下，HY5調(diào)控植物響應(yīng)光信號(hào)進(jìn)而控制氣孔發(fā)育，在短日照生長(zhǎng)條件下沒有影響。這些研究表明在HY5調(diào)控作用下，氣孔感知光信號(hào)的不確定性，也同樣表明HY5在蒸騰作用中提供了額外的動(dòng)力。
除了光以外，糖也會(huì)影響下胚軸伸長(zhǎng)。己糖激酶1是一種葡萄糖磷酸化酶，除催化作用外，還會(huì)介導(dǎo)糖感應(yīng)，并支持糖誘導(dǎo)的下胚軸生長(zhǎng)。編碼的己糖激酶1基因HXK1會(huì)在保衛(wèi)細(xì)胞中進(jìn)行特異性表達(dá)，導(dǎo)致下胚軸比野生型幼苗長(zhǎng)三倍。除下胚軸生長(zhǎng)以外，HXK1的表達(dá)大約減少20%的蒸騰作用。
擬南芥Col-0生態(tài)型,pif4-101,hy5,
GCHXK,GCGFP,GCPIF4/pif4
GCHY5/hy5,GCHKX/GCHY5,
GCHXK/GCHY5/hy5,GCHXK/hy5,GCHY5-GFP,GCHXK/GCHY5-GFP
所有擬南芥光照條件，光強(qiáng)為150 μmol m-2 s-1，10個(gè)小時(shí)光照。溫度在20-22?C，濕度50% - 60%。擬南芥栽培基質(zhì)為30%的蛭石，30%的泥炭，20%的凝灰?guī)r，20%的珍珠巖的混合基質(zhì)。煙草栽培基質(zhì)為70%的凝灰?guī)r，30%的泥炭的混合基質(zhì)。擬南芥種植時(shí)間為2020年1月至2月，煙草種植時(shí)間為2019年9月，栽培地為半控制自然光條件下的溫室。
構(gòu)建含有保衛(wèi)細(xì)胞的特異性啟動(dòng)子
KST1（KSTppro::AtHY5）的HY5基因表達(dá)載體，使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法侵染煙草葉盤。
該試驗(yàn)使用功能表型系統(tǒng)平臺(tái)，測(cè)定全植物每日的蒸騰速率。將野生型或者轉(zhuǎn)基因的擬南芥或者煙草，每棵煙草單獨(dú)種植在3.9L的盆中，每4棵擬南芥種植在3.9L的盆中。每個(gè)盆放置在稱重單元上密封，防止生長(zhǎng)培養(yǎng)基表面蒸發(fā)，每10s會(huì)采集1次數(shù)據(jù)，將3min以內(nèi)采集的數(shù)據(jù)做平均進(jìn)行下一步分析。將植物的蒸騰速率標(biāo)準(zhǔn)化為重量或者總?cè)~面積。在整個(gè)試驗(yàn)過程檢測(cè)光合有效輻射PAR值，以及飽和水汽壓虧缺VPD值。試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)植物進(jìn)行干重測(cè)量。
使用LI-600熒光氣孔計(jì)（LI-COR,USA）測(cè)量蒸騰速率與氣孔導(dǎo)度，使用LI-6800便攜式光合儀（LI-COR,USA）進(jìn)行葉片氣體交換測(cè)量分析，測(cè)量過程控制環(huán)境變量，光強(qiáng)在200 μmol m-2 s-1，二氧化碳濃度在400 μmol mol-1。藍(lán)光光合有效光量子通量密度設(shè)置在5%，流量設(shè)置為150 μmol/s，飽和水汽壓虧缺在1-1.1kPa之間，葉片溫度在22?C。
對(duì)于圖1、圖4中描述的葉面積測(cè)量，移除葉子，移除整個(gè)蓮座結(jié)，使用LI-3100（LI-COR,USA）葉面積儀確定分析面積，使用ImageJ軟件
全葉蒸騰速率E除以葉片水勢(shì)Δ leaf，計(jì)算每片葉子的Kleaf。Δleaf =?Ψleaf，光處理 – Ψleaf，暗處理。E測(cè)量完畢后將葉子轉(zhuǎn)移到壓力室（ARIMAD-3000, Israel）來確定?Ψleaf，光處理。然后將同一植物的另外一片葉子完全覆蓋錫箔紙，轉(zhuǎn)移到壓力室去測(cè)量Ψleaf，暗下，測(cè)量在10:00-13:00（開燈后1-4個(gè)小時(shí)）進(jìn)行。
使用Leica SP8激光掃描顯微鏡（Leica，German）對(duì)GCHY5-GFP成熟植物進(jìn)行圖像采集，使用488nm激光獲取GFP信號(hào)圖像，Hyd檢測(cè)器在500-525nm范圍內(nèi)檢測(cè)發(fā)射。使用PMT檢測(cè)器在650-750nm范圍內(nèi)檢測(cè)葉綠體的自發(fā)熒光。
對(duì)于氣孔密度和指數(shù)測(cè)量，去除表皮并立即進(jìn)行成像，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)隨機(jī)選擇三個(gè)區(qū)域進(jìn)行掃描和平均（n=10）。在每個(gè)區(qū)域中，氣孔和表皮細(xì)胞，均在明場(chǎng)倒置顯微鏡下成像（1M7100 Zeiss,Germany）。顯微鏡上安裝有HV-D30CCD（Hitachi,Japan）顯微鏡尺（Olympus, Japan）用于校準(zhǔn)尺度。
使用JMP 16軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Student t檢驗(yàn)、Tukey的HSD檢驗(yàn)或Dunnett方法比較平均值。當(dāng)P<0.05時(shí)，平均值被認(rèn)為存在顯著差異。
3.結(jié)果
植物的光反應(yīng)由PIF4和HY5等轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)，PIF4促進(jìn)下胚軸伸長(zhǎng)，HY5則阻礙下胚軸伸長(zhǎng)，HY5和PIF4存在對(duì)光的特異性反應(yīng)，而光對(duì)蒸騰作用影響較深，所以探究HY5和PIF4對(duì)植物蒸騰作用的影響。假設(shè)PIF4與HY5轉(zhuǎn)錄因子以拮抗作用的方式改變蒸騰作用。使用氣體分析儀測(cè)定轉(zhuǎn)基因擬南芥的AtPIF4（GCPIF4）或AtHY5（GCHY5）植物的蒸騰速率，在擬南芥WT植物的保衛(wèi)細(xì)胞中，GCPIF4植物表現(xiàn)出較低的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率（圖1，A與B）。雖然低蒸騰量可能會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制，但是沒有在GCPIF4植物中觀察到生物量的減少（圖1，C與D）。
圖1 擬南芥，WT為野生型，#4，#5，兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因株系，GCPIF4為在保衛(wèi)細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。圖A為蒸騰速率的變化，圖B為氣孔導(dǎo)度的變化，圖C為干重的變化，圖D為葉面積變化的箱線圖。方框內(nèi)的線表示中值（n=8-10）。星號(hào)表示轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)于野生型的顯著差異（Dunnett檢驗(yàn)，P<0.05）。
與GCPIF4植物相反的是，與WT相比，GCHY5植物表現(xiàn)出更高的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度（圖2，A與B），植物出現(xiàn)了生長(zhǎng)抑制（圖2，C）。
圖2 圖ABC為擬南芥植物，圖DEF為煙草植物。圖A為野生型與轉(zhuǎn)基因不同株系的蒸騰速率，圖B為野生型與轉(zhuǎn)基因不同株系的氣孔導(dǎo)度，圖C為野生型與轉(zhuǎn)基因不同株系的干重。圖ABC方框內(nèi)線為中值（n=8-12）。圖D為日動(dòng)態(tài)變化下的飽和水汽壓虧缺與光合有效輻射值，圖E為蒸騰速率的日動(dòng)態(tài)變化，圖F為日中（10:00-12:00）蒸騰速率變化，圖F方框內(nèi)線中值為（n=17-18）。星號(hào)表示轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)于野生型的顯著差異（Dunnett檢驗(yàn)，P<0.05）。
在保衛(wèi)細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)HY5-GFP融合基因，也觀察到類似現(xiàn)象（圖3），在成熟葉子的保衛(wèi)細(xì)胞中觀察到GFP熒光信號(hào)（圖3，A），且出現(xiàn)較高的氣孔導(dǎo)度（圖3，C），和生長(zhǎng)抑制（圖3，D與E）。這些結(jié)果進(jìn)一步表明GCHY5會(huì)促進(jìn)蒸騰。為了探究HY5轉(zhuǎn)錄因子的作用，以及其對(duì)蒸騰作用的影響，在煙草中轉(zhuǎn)入GCHY5基因，其中GCHY5含有保衛(wèi)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)。通過使蒸滲儀刻度系統(tǒng)，連續(xù)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)入GCHY5基因植物的全株晝夜蒸騰行為，連續(xù)測(cè)量水分耗散，光強(qiáng)和飽和水汽壓虧缺日動(dòng)態(tài)變化（圖2，D），以及蒸騰速率（圖2，E）。在擬南芥日動(dòng)態(tài)蒸騰速率監(jiān)測(cè)中，發(fā)現(xiàn)在上午轉(zhuǎn)入GCHY5基因的蒸騰速率高于野生型WT（圖2，E與F）。結(jié)果進(jìn)一步支持HY5基因在保衛(wèi)細(xì)胞中特異性表達(dá)進(jìn)而提高蒸騰速率。
圖3 在成熟葉片葉肉保衛(wèi)細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)HY5，增強(qiáng)氣孔導(dǎo)度，阻止生長(zhǎng)。圖AB，含有編碼綠色熒光蛋白GFP的融合基因的轉(zhuǎn)基因株系。HY5-GFP在表皮中分布，白色箭頭表示目標(biāo)基因在保衛(wèi)細(xì)胞中的位置（染成綠色），橙色箭頭表示目標(biāo)基因在葉肉細(xì)胞的位置（染成洋紅色），白色比例尺為50μm。圖CDE為野生型與轉(zhuǎn)基因株系的不同指標(biāo)，圖C為野生型與轉(zhuǎn)基因株系的氣孔導(dǎo)度，圖D為野生型與轉(zhuǎn)基因株系的干重，圖E為野生型與轉(zhuǎn)基因株系的蓮座面積。
pif4擬南芥突變體比野生型WT有著更高的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，但在pif4突變體中再轉(zhuǎn)入GCPIF4，就會(huì)抑制氣孔導(dǎo)度與蒸騰速率的高表達(dá)。測(cè)量轉(zhuǎn)入GCPIF4的pif4突變體的光合速率，發(fā)現(xiàn)其光合速率與野生型pif4突變體中表達(dá)相差不大（圖4，C），轉(zhuǎn)基因植物與突變體相比，光合速率變化不大，蒸騰速率降低，由此而導(dǎo)致其水分利用效率有所提高（圖4，D）。在轉(zhuǎn)入GCPIF4的pif4突變體中，蒸騰作用降低不會(huì)使植株生物量受損（圖4，E與F）。
結(jié)果表明光敏色素轉(zhuǎn)錄因子PIF4在植物蒸騰作用中起到核心作用，此外在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)的GCPIF4，不會(huì)受到存在于其他組織細(xì)胞中的PIF4的影響。
圖4 在pif4突變體中轉(zhuǎn)入GCPIF4進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證，轉(zhuǎn)入之后發(fā)現(xiàn)植株水分利用效率有所增強(qiáng)。圖A到D分別為不同樣本的氣孔導(dǎo)度，蒸騰速率，光合速率，以及水分利用效率的變化。WT為野生型擬南芥，pif4為突變體，GCPIF4/pif4 #5為在突變體中轉(zhuǎn)入GCPIF4進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因5號(hào)株系，GCPIF4/pif4 #15，為轉(zhuǎn)基因15號(hào)株系。方框內(nèi)線為中值（A到D，n=6-12。EF，n=8-12）。采用Tukey's HSD檢驗(yàn)，P ?<0.05不同字母表示差異顯著。
3.3 在突變體hy5的保衛(wèi)細(xì)胞中過表達(dá)GCHY5會(huì)提高蒸騰速率
采用蒸滲系統(tǒng)測(cè)量全株植物的蒸騰速率，測(cè)量在hy5突變體保衛(wèi)細(xì)胞中過表達(dá)ATHY5的蒸騰速率。GCHY5/hy5植物相比突變體hy5和野生型植物WT，一天中蒸騰速率顯著增加（圖5，A）。日中蒸騰速率（平均12:00-14:00），當(dāng)蒸騰處于峰值時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系GCHY5/hy5 #7 ，轉(zhuǎn)基因株系GCHY5/hy5 #12，分別比擬南芥突變體hy5高25%，9%。結(jié)果表明在保衛(wèi)細(xì)胞中HY5轉(zhuǎn)錄因子對(duì)蒸騰作用起到正向調(diào)節(jié)。
GCHY5/hy5植物與hy5突變體光合能力相似（圖5，C），但這些轉(zhuǎn)基因株系蒸騰速率較高，所以水分利用效率IWUE相對(duì)較低。只在轉(zhuǎn)基因株系GCHY5/hy5 #12中發(fā)現(xiàn)干重顯著降低，阻礙了生物量的增長(zhǎng)（圖5，E）。與WT背景下過表達(dá)GCHY5相比，GCHY5在突變體hy5內(nèi)對(duì)植物生長(zhǎng)的影響是微弱的（圖2，C）（圖3，D與E）。
圖5 在擬南芥hy5突變體中轉(zhuǎn)入GCHY5促進(jìn)蒸騰，樣本為擬南芥野生型WT，突變體hy5，以及在hy5突變體保衛(wèi)細(xì)胞中特異性表達(dá)hy5的轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)基因株系GCHY5/hy5 #12，轉(zhuǎn)基因株系GCHY5/hy5 #7。圖A為四類樣本蒸騰速率日變化動(dòng)態(tài)，圖B為四類樣本日中（12:00-14:00）蒸騰速率的平均值（n=6），圖C為四類樣本的光合速率，圖D為四類樣本的水分利用效率IWUE。圖B與E箱線圖中值為6，圖C與D箱線圖中值為6-8。星號(hào)表示相對(duì)于hy5而言有著顯著差異（Dunnett檢驗(yàn)，P<0.05）。
保衛(wèi)細(xì)胞中的HY5轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)蒸騰作用，有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子GCHY5可抵消由己糖激酶HXK引導(dǎo)的幼苗下胚軸伸長(zhǎng)效應(yīng)。在幼苗中GCHY5會(huì)終止下胚軸生長(zhǎng)，HXK不僅會(huì)促進(jìn)下胚軸生長(zhǎng)，且在成熟植物中會(huì)導(dǎo)致20%的蒸騰速率降低。本研究探討在植物中GCHY5能否逆轉(zhuǎn)GCHXK導(dǎo)致的蒸騰降低作用。GCHY5/GCHXK/WT為野生型植株背景下共轉(zhuǎn)入GCHY5/GCHXK。GCHY5/GCHXK/hy5在hy5突變體背景共轉(zhuǎn)入GCHY5/GCHXK。
結(jié)果表明在野生型植物背景下共轉(zhuǎn)入GCHY5/GCHXK的植物蒸騰速率高于僅轉(zhuǎn)入GCHXK的樣本。說明GCHY5在野生型植物的背景下表達(dá)可逆轉(zhuǎn)GCHXK引發(fā)的低蒸騰量（圖6，A與B）,但在hy5突變體背景下，GCHXK/GCHY5/hy5的蒸騰速率與GCHXK的植株一樣蒸騰速率較低，也許僅在保衛(wèi)細(xì)胞HY5轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，不足以逆轉(zhuǎn)GCHXK誘導(dǎo)的低蒸騰作用，GCHY5的逆轉(zhuǎn)作用的發(fā)生也許同樣需要其他組織細(xì)胞中存在AtHY5。
在GCHY5/GCHXK/WT與GCHXK/GCHY5/hy5樣本中，葉片水力傳導(dǎo)率Kleaf與野生型植物的并無顯著差異，而GCHXK樣本中的Kleaf顯著增加，與之前研究相似。另外之前研究轉(zhuǎn)入GCHY5會(huì)提高蒸騰作用，而這與葉片的水力導(dǎo)度沒有明顯關(guān)系。
圖6 GCHY5逆轉(zhuǎn)GCHXK的低蒸騰作用的能力取決于內(nèi)源AtHY5的表達(dá)，對(duì)葉片水力傳導(dǎo)。圖A在GCHXK/GCHY5/hy5，GCHXK/GCHY5/WT，GCHXK，WT樣本下的蒸騰速率，圖B在GCHXK/GCHY5/hy5，GCHXK/GCHY5/WT，GCHXK，WT樣本下的日中（12:00-14:00）蒸騰速率，平均值（n=6），箱線圖中值（n=6），圖C為在GCHXK/GCHY5/hy5，GCHXK/GCHY5/WT，GCHXK，WT樣本下的葉片水力傳導(dǎo)率Kleaf，箱線圖中值（n=10-14）。星號(hào)表示與野生型相比有顯著影響
使用保衛(wèi)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，在保衛(wèi)細(xì)胞中特異性表達(dá)，PIF4降低蒸騰速率，HY5則會(huì)提高蒸騰速率。除了特異性啟動(dòng)子，最近研究表明PIF在組成型啟動(dòng)子下表達(dá)也會(huì)影響蒸騰。在玉米以及胡蘿卜中過表達(dá)ZmPIF3、ZmPIF1和DcPIF3導(dǎo)致蒸騰作用降低，但耐旱性有所提高。在pif3，pif4擬南芥雙突變體中，氣孔孔徑大于野生型植株。